一个研究小组为SaccharolobusislandicusREY15A构建了多功能遗传工具，这是用于古细菌生物学和CRISPR生物学研究的极少数古细菌模型之一。

这些工具包括高效的基因组编辑、强大的蛋白质表达系统、干扰质粒测定、基因沉默和基于CRISPR的基因编辑。然而，迄今为止，为这个裂痕构建的质粒载体仅基于pRN2神秘质粒。

这项研究发表在mLife上，由中国青岛山东大学的佘群新教授和袁冠华博士领导。

“需要双宿主载体系统来丰富这个模型古菌的遗传工具箱，”佘教授说。

事实上，在古细菌载体发育的早期阶段，pRN1和pRN2质粒在Sa中共存。islandicusREN1H1用于构建Sa的穿梭载体。基于这两个质粒的islandicusREY15A;pRN2衍生的质粒获得了高转化率并产生了真正的转化体，而基于pRN1的载体仅产生了很少的菌落，其中明显不存在质粒。

“由于CRISPR阵列通常携带与硫化叶菌目中的各种质粒相匹配的间隔区，因此我们怀疑Sa.islandicusREY15A的基因组可能携带与pRN1中的序列匹配的间隔区，但与pRN2中的序列不匹配，”Yuan博士说。

在确定了Sa的完整基因组序列后。islandicusREY15A4中，宿主基因组确实携带间隔区(L2S56)，仅显示与pRN1复制酶基因编码序列中的DNA片段(目标N1)有两个错配。转化效率实验表明，L2S56crRNA的表达水平足以引发I-A免疫，但不足以触发III-B免疫以消除Sa中的质粒。岛菌REY15A。

为了获得逃避宿主CRISPR免疫的功能性靶标N1衍生物，团队基于pRN1靶标设计了三个DNA片段(N1a、N1b和N1c)，而N1a中设计的突变是同义突变，N1b和N1c存在错义突变。结果表明，古细菌宿主中的CRISPR系统没有针对这三个突变目标。然而，随后的实验表明，N1c携带错义突变，可能导致复制蛋白失活。

通过构建一系列载体，Saccharolobus-E.基于pRN1骨架设计了带有N1a突变、argD选择标记、p15A复制起点和卡那霉素抗性标记的大肠杆菌穿梭载体pN1dAA，它可以在Sa中与pRN2衍生的质粒pSeSD稳定共存。岛菌REY15A细胞。这产生了用于利用这种重要的古菌模型进行遗传研究的双质粒系统。

由于宿主-质粒冲突的检查为鉴定兼容的质粒-载体系统提供了一种有用的方法，因此一旦通过实验解决冲突，工程化质粒对于开发宿主-载体系统非常有用，如本文所述。