顶复门寄生虫是一种常见的疾病病因，每年感染数亿人。它们是传播疟疾、隐孢子虫病(一种严重的儿童腹泻病)和弓形虫病(一种危及免疫功能低下人群和胎儿的疾病，也是孕妇被告知不要更换猫砂的原因)的罪魁祸首。

顶复门寄生虫非常擅长感染人类和许多其他动物，并在它们体内存活。研究人员对顶复门感染宿主的方式了解得越多，他们就越能开发出针对这种寄生虫的有效治疗方法。

为此，怀特黑德研究所成员SebastianLourido实验室的研究人员在研究生ChristopherGiuliano的带领下，完成了对引起弓形虫病的顶复门寄生虫弓形虫(T.gondii)感染小鼠期间的全基因组筛查。该筛查显示了每个基因对于寄生虫感染宿主的能力的重要性，为基因功能提供了线索。

在7月8日发表在《自然微生物学》杂志上的文章中，研究人员分享了他们追踪活宿主中寄生虫谱系的方法，以及一些具体的有趣的发现——包括可能的抗寄生虫药物靶点。

从菜肴到动物

2016年，Lourido实验室的研究人员曾开发出一种筛选方法，用于在培养皿中测试细胞中每个弓形虫基因的功能。他们利用CRISPR基因编辑技术制造出突变寄生虫，其中每个谱系都有一个基因失活。

然后，研究人员可以根据缺失该基因的突变体的表现情况，评估每个基因对寄生虫适应性或生长能力的重要性。如果突变体死亡，则意味着其失活基因对于寄生虫的生存至关重要。

这次筛选让研究人员了解到很多有关弓形虫生物学的知识，但也面临一个共同的局限性：寄生虫是在培养皿中而不是活体宿主中进行研究的。细胞培养提供了一种研究寄生虫的更简单的方法，但其条件与寄生虫在动物宿主中面临的条件不同。宿主体内的环境更复杂、更动态，因此寄生虫可能需要依赖在人工细胞培养环境中不需要的基因。

为了克服这一限制，Lourido实验室的研究人员想出了如何在活体小鼠中重复弓形虫全基因组筛查，而他们的同事此前曾在细胞培养中进行过这项筛查。这是一项艰巨的任务，需要解决各种技术难题并进行大量平行实验。

弓形虫有大约8,000个基因，因此研究人员进行了混合实验，每只小鼠被许多不同的突变体感染——但感染量不会多到让小鼠无法承受。这意味着研究人员需要一种方法来更密切地监测小鼠体内突变体的轨迹。

他们需要追踪携带相同突变的寄生虫的谱系随时间的变化，因为这将使他们能够了解特定突变体的不同复制谱系的表现。

研究人员在CRISPR工具中添加了条形码，可灭活寄生虫中感兴趣的基因。当他们收获寄生虫的后代时，条形码会识别谱系，区分以相同方式发生突变的复制寄生虫。

这使得研究人员能够使用基于种群的分析方法来排除错误结果并降低实验噪音。然后他们可以得出关于每个谱系表现如何的结论。谱系追踪使他们能够绘制不同寄生虫种群在宿主体内的传播方式，以及某些种群是否在一个器官中比另一个器官中生长得更好。

研究人员发现，有237个基因对寄生虫在活体宿主中的适应性影响大于在细胞培养物中的影响。其中许多基因以前并不知道对寄生虫的适应性很重要。当前筛选中发现的基因在寄生虫的不同部位活跃，并影响其与宿主相互作用的不同方面。

研究人员还发现，当某个基因失活时，寄生虫在活宿主体内的适应性会提高;例如，这些基因可能与宿主免疫系统用来检测寄生虫的信号有关。接下来，研究人员跟踪了几个特别令人感兴趣的改善适应性的基因。

导致活体宿主差异的基因

其中一个引人注目的基因是GTP环化水解酶I(GCH)，它编码一种参与生产必需营养叶酸的酶。顶复虫依赖叶酸，因此研究人员想了解GCH在为寄生虫获取叶酸方面的作用。

细胞培养基中含有高浓度的叶酸，在这种营养丰富的环境中，GCH并非必不可少。然而，在活小鼠中，寄生虫必须清除叶酸并使用含有GCH的代谢途径合成叶酸。Lourido和Giuliano揭示了该途径如何运作的新细节。

尽管之前GCH的作用尚未完全了解，但叶酸对顶复门昆虫的重要性是众所周知的弱点，已用于设计抗寄生虫疗法。抗叶酸药物乙胺嘧啶通常用于治疗疟疾，但许多寄生虫对其产生了抗药性。

一些耐药的顶复虫增加了它们所拥有的GCH基因拷贝数，这表明它们可能利用GCH介导的叶酸合成来抵抗乙胺嘧啶。研究人员发现，将GCH抑制剂与乙胺嘧啶结合使用可以提高该药物对抗寄生虫的疗效。

GCH抑制剂本身也有效。不幸的是，目前可用的GCH抑制剂靶向哺乳动物和寄生虫的叶酸通路，因此对动物使用不安全。Giuliano及其同事正在开发一种针对寄生虫的GCH抑制剂，作为一种可能的治疗方法。

“之前，叶酸代谢途径中有一半对寄生虫来说并不重要，只是因为人们在细胞培养基中添加了太多叶酸，”Giuliano说。“这是细胞培养实验中可能被忽略的一个很好的例子，特别令人兴奋的是，这一发现让我们找到了一种新的候选药物。”

另一个感兴趣的基因是RASP1。研究人员确定RASP1不参与初次感染尝试，但如果寄生虫失败并需要进行第二次尝试，则需要它。

他们发现，RASP1是寄生虫重新装载一种名为棒状体的细胞器所必需的，寄生虫利用这种细胞器突破并重新编程宿主细胞。如果没有RASP1，寄生虫只能部署一组棒状体，因此只能尝试一次入侵。

确定RASP1在感染中的作用也证明了研究寄生虫如何与不同细胞类型相互作用的重要性。在细胞培养中，研究人员通常在成纤维细胞(一种结缔组织细胞)中培养寄生虫。

研究人员发现，寄生虫可以入侵成纤维细胞，无论是否有RASP1，这表明这种细胞类型对它们来说很容易入侵。然而，当寄生虫试图入侵巨噬细胞(一种免疫细胞)时，没有RASP1的寄生虫往往会失败，这表明巨噬细胞给寄生虫带来了更大的挑战，需要多次尝试。

该筛选发现了其他可能的细胞类型特异性途径，而这些途径在仅使用培养皿中的模型细胞类型时是无法发现的。

筛选结果还突出了一个之前未命名的基因，研究人员将其称为GRA72。之前的研究表明，该基因在寄生虫在自身周围形成的液泡或保护膜中发挥作用。Lourido实验室的研究人员证实了这一点，并发现了GRA72缺失如何破坏寄生虫液泡的更多细节。

未来的丰富资源

Lourido、Giuliano和同事们希望他们的研究结果能为寄生虫生物学提供新的见解，尤其是在GCH的情况下，带来新的治疗方法。他们打算继续从这一宝库中汲取经验——他们的筛选确定了许多其他需要后续研究的感兴趣基因——以进一步了解顶复门寄生虫及其与哺乳动物宿主的相互作用。

卢里多表示，他实验室的其他研究人员已经利用筛选结果在自己的项目中寻找相关基因和途径。

“这是一项杰出的资源，”麻省理工学院生物学副教授Lourido说道。“筛查结果揭示了寄生虫与宿主之间更广泛的相互作用方式，并丰富了我们对寄生虫能力和弱点的认识。”