利用新的高通量方法揭示微生物基因组的奥秘

劳伦斯伯克利国家实验室(伯克利实验室)开发的一项新技术将使研究人员更容易发现微生物中功能未知的基因编码的特征或活动，这是了解单个物种的作用和影响的关键一步。

这种方法被称为条形码过表达细菌散弹枪文库测序(Boba-seq)，8月5日发表在《自然通讯》上的一篇论文对此进行了描述。

“微生物世界中存在如此多的遗传暗物质——我们可以用当今的方法快速测序但不知道其功能的DNA。问题是，我们如何研究所有这些物质以了解我们周围的微生物群?根本的答案是——像这样，”伯克利实验室生物科学领域的资深科学家、资深作者亚当·阿尔金(AdamArkin)说。

Boba-seq涉及从感兴趣的细菌中提取随机DNA片段并在宿主细菌细胞中表达它们。

“我们的想法是，我们可以看到新基因的存在如何导致该细菌生长表型的差异，”第一作者YolandaHuang说道，她是布法罗大学微生物学和免疫学助理教授，在研究期间是Arkin实验室的博士后研究员。“这是一种功能基因组学方法，我们可以用它快速将基因或DNA序列与潜在功能联系起来。”

名称中的“条形码”一词指的是一小段DNA，科学家将其用作更大DNA片段的识别标签，就像杂货店的条形码用一小段代码识别特定商品一样。被研究生物体的整个基因组被随机分成包含单个基因或多个基因簇的片段，然后插入已用独特条形码标记的质粒(环状DNA包)。

Boba-seq“文库”是指包含来自生物体片段的所有条形码质粒。该文库可以引入不同的细菌宿主，以产生大量遗传变异，然后筛选出新的行为或特性。

Arkin和他的生物科学领域的同事是研究基因功能的高通量技术的顶尖专家，并参与发明了许多其他通过插入或沉默基因来研究其功能的技术，包括RB-TnSeq、CRISPRi和Dub-Seq。

使用Boba-seq，数十万个条形码片段可以放入宿主细胞中，并在不同条件下培养，以在单个实验中确定功能。例如，如果带有特定条形码的细胞在整个培养物暴露于抗生素时生长良好，但其他细胞亡，你就知道该片段中的基因编码了抗生素抗性特征。而且，由于条形码的存在，识别负责这种新能力的片段既便宜又快速。

Arkin表示：“Yolanda对Boba-seq的创新使我们能够识别出数十万个片段中的哪些片段赋予了我们想要的表型或特性。我们的新策略使我们能够构建文库并以比以前的过表达方法更高的通量使用它们。”

另一项重大突破是，Boba-seq片段可以在提取它们的同一生物体(或近亲)中进行测试，这对于准确了解基因的功能至关重要。以前的技术受到限制，因为它们只测试了大肠杆菌和酵母等模型生物体内的基因。来自与大肠杆菌非常不同的生物体的基因通常在大肠杆菌中不起作用，因此很难或不可能清楚地了解基因的作用。

用于处理Boba-seq实验室工作结果的计算工具可在开源平台上供其他研究人员使用。

“我很高兴看到其他人可能会在世界范围内使用Boba-seq，尤其是用于肠道或环境的宏基因组学研究，”论文合著者、加州大学伯克利分校Arkin实验室研究生AllisonHung说道。“无需分离即可从微生物群落中提取功能信息，这节省了大量的时间和资源，对于研究难以在实验室中培养的微生物(例如目前作为ENIGMA的一部分研究的生活在复杂生态系统中的微生物)来说，这至关重要。”

ENIGMA是“集成基因和分子组装的生态系统和网络”的缩写，是美国能源部(DOE)的一个科学重点领域，由Arkin共同领导，旨在了解微生物群落如何通过生态系统循环营养物质并解毒有毒重金属污染物。

在构建和改进Boba-seq之后，Arkin的团队通过研究拟杆菌目中的基因来测试这项新技术。拟杆菌目是一种微生物分类目，在人类肠道中大量存在，已知在我们的内部微生物群中发挥着多种作用。拟杆菌目也是陆地土壤过程的主要参与者，它们分解有机物并将养分返回植物。该团队从六种拟杆菌目物种的文库中生成了305,000个条形码片段，并同时评估了超过21,000个蛋白质编码基因。

这些原理验证实验的结果表明，编码构建某些脂质分子的酶的基因赋予了对头孢曲松(一种头孢菌素类抗生素)的耐药性。这些基因之前并未与抗生素耐药性联系起来，值得进一步研究。

研究小组还发现了碳水化合物代谢中的几种新功能，包括代谢葡萄糖胺所需的酶，葡萄糖胺是一种在骨骼、结缔组织和昆虫和甲壳类动物的外骨骼中发现的经过修饰的糖分子。在肠道中，微生物使用葡萄糖胺作为能量分子并构建细胞壁，而构成肠道内壁的人体细胞则利用它来产生粘膜，帮助维持健康的营养吸收并防止病原体入侵。

黄说，这些关于拟杆菌的见解将有助于卫生研究人员更好地了解肠道功能，因为这种菌种“大多数时候充当共生菌，真正维持肠道健康。但在某些情况下，拟杆菌释放的营养物质可被病原体利用来支持自身的生长。”

Arkin和他的ENIGMA同事目前正在使用Boba-seq研究土壤微生物如何从环境中大多数生命形式无法代谢的复杂碳基分子中获取能量。与此同时，Huang计划在布法罗大学雅各布斯医学与生物医学科学学院的新实验室中使用Boba-seq研究细菌用来逃避噬菌体(感染细菌的病毒)攻击、提高肠道定植效率和分解复杂碳水化合物的基因。

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