底物水平磷酸化是一种在细胞代谢过程中，通过底物分子中的高能键直接转移磷酸基团至ADP（腺苷二磷酸）形成ATP（腺苷三磷酸）的化学反应过程。这一过程主要发生在糖酵解和TCA循环（柠檬酸循环）中，是生物体内产生能量的一种重要方式。
在糖酵解过程中，当1,3-二磷酸甘油酸（1,3-BPG）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）等化合物分解时，会释放出一个高能磷酸键，这个磷酸键可以将ADP磷酸化为ATP。例如，在糖酵解途径的最后一步，磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）在丙酮酸激酶的作用下，将其磷酸基团转移到ADP上，从而生成ATP和丙酮酸。
而在TCA循环中，琥珀酰辅酶A会在琥珀酰辅酶A合成酶的作用下，与GTP（鸟苷三磷酸）或ADP发生反应，将自身的磷酸基团转移给GDP（鸟苷二磷酸）或ADP，生成GTP或ATP和琥珀酸。这一步骤虽然主要生成的是GTP，但GTP同样可以在细胞内转化为ATP，因此也是细胞能量供应的重要来源之一。
与氧化磷酸化相比，底物水平磷酸化的效率较低，但在某些特定条件下，如在缺氧环境下，它能够为细胞提供必要的能量。同时，底物水平磷酸化也是细胞代谢网络中不可或缺的一部分，对于维持细胞正常的生命活动具有重要意义。
