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大肠杆菌感受态细胞的制备注意事项(大肠杆菌感受态细胞的制备)

来源:综合资讯2024-04-04 06:50:10
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您好,今日明帅来为大家解答以上的问题。大肠杆菌感受态细胞的制备注意事项,大肠杆菌感受态细胞的制备相信很多小伙伴还不知道,现在让我们一起来看看吧!

1、(1)质粒DNA的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的,转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,则会使转化率下降。

2、一般地,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%,1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。

3、对于以质粒为载体的重组分子而言,分子量大的转化效率低,实验证明,大于30kb的重组质粒将很难进行转化。

4、此外,重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关,环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍,因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。

5、 (2)感受态细胞的质量: 所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的,并用最纯净的水配制,最好分装保存于4℃ (3)细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

6、不要用已经过多次转接,及贮存在4℃的培养菌液。

7、细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。

8、即应用对数期或对数生长前期的细菌,可通过测定培养液的OD600控制。

9、对TG1菌株,OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右。

10、(应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同)。

11、密度过高或不足均会使转化率下降。

12、 (二)感受态细胞转化中的影响: 整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,移液枪头等最好是新的,并经高压灭菌处理。

13、所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。

14、整个操作均需在冰上进行,不能离开冰浴,否则细胞转化率将会降低。

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